Was ist Durchflusszytometrie?

Die Durchflusszytometrie (CMF) ist eine Referenztechnik für die Analyse von Partikeln, die in einer Flüssigkeit suspendiert sind. Sie ermöglicht die gleichzeitige Messung mehrerer physikalischer und biologischer Eigenschaften jedes Partikels. Dies ist typischerweise bei Zellen oder Bakterien mit einem Durchsatz von bis zu mehreren tausend Ereignissen pro Sekunde der Fall.

Das Prinzip beruht auf der hydrodynamischen Injektion der Probe in einen Strom. Dadurch werden die Teilchen gezwungen, sich in einer Reihe aufzustellen, um nacheinander einen oder mehrere fokussierte Laserstrahlen zu durchlaufen. Jedes Partikel streut bei seiner Wechselwirkung mit dem Strahl Licht. Spezifische Fluorophore können es markieren, so dass es ein Fluoreszenzsignal aussendet. Das kleinwinklig gestreute Licht (FSC - Forward Scatter) liefert einen Schätzwert für die Zellgröße. Während die seitliche Streuung (SSC - Side Scatter) Auskunft über die interne Komplexität, wie z.B. die zytoplasmatische Granularität, gibt. Fluoreszenzsignale wiederum spiegeln die Expression bestimmter biologischer Ziele wider.

Diese Lichtsignale werden von einem Netzwerk von Fotodetektoren (Fotodioden, Fotomultiplikatoren) gesammelt. Sie werden dann in elektrische Signale umgewandelt, digitalisiert und in Echtzeit analysiert. Die Durchflusszytometrie ermöglicht es somit, zelluläre Subpopulationen zu klassifizieren, zu quantifizieren und zu sortieren. Dies geschieht auf der Grundlage mehrerer Kriterien gleichzeitig, mit hoher Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit.

Wie funktioniert die Durchflusszytometrie?

Ein Durchflusszytometer ist um drei Hauptuntersysteme herum aufgebaut: Fluidik, Optik und Detektionselektronik. Diese Module arbeiten synergistisch zusammen, um eine zuverlässige und reproduzierbare Analyse jedes gemessenen Ereignisses zu gewährleisten.

Das Fluidsystem

Der Kern des Fluidsystems beruht auf dem Prinzip der hydrodynamischen Fokussierung. Die zu analysierende Probe wird in die Mitte eines Stroms injiziert, der aus einer physiologisch neutralen Flüssigkeit besteht. Dadurch werden die Partikel dazu gezwungen, in einer einzigen Reihe zu fließen. Diese Konfiguration stellt sicher, dass die detektierten Ereignisse jeweils nur einem Partikel entsprechen. Auf diese Weise werden Überschneidungen oder Zählfehler vermieden.

Das optische System

Die ausgerichteten Partikel gelangen dann in die Analysekammer. Sie werden von einem oder mehreren Lasern mit bestimmten Wellenlängen beleuchtet. Das einfallende Licht wird entweder gestreut oder absorbiert und dann in Form von Fluoreszenz wieder ausgestrahlt, wenn das Partikel markiert ist. Sammellinsen und andere optische Elemente lenken das Licht auf verschiedene Detektoren.

Sowohl die FSC- als auch die SSC-Streuung ermöglichen eine physikalische Schätzung (Größe und Komplexität). Fluoreszenzsignale hingegen offenbaren je nach verwendetem Marker biologische oder biochemische Informationen über das Partikel.

Das Erkennungssystem

Fotodioden oder Photomultiplier (PMT) wandeln jedes optische Signal in ein elektrisches Signal um, das dann von einem System digitalisiert wird. Die nachgeschaltete Verarbeitung erfolgt über spezielle Software, die die gemessenen Parameter extrahiert.

Die Qualitätskontrolle des Zytometers umfasst regelmäßige Kalibrierungen mit standardisierten Fluoreszenzbeads. Dies gewährleistet die Stabilität und Vergleichbarkeit der Messungen im Laufe der Zeit.

Konkrete Anwendungen der Durchflusszytometrie

Die Durchflusszytometrie ist heute aus vielen Bereichen der Biowissenschaften nicht mehr wegzudenken, da sie die einzigartige Fähigkeit besitzt, Tausende von Zellen schnell und einzeln mit einer multiparametrischen Auflösung zu analysieren.

Immunphänotypisierung und Hämatologie

Eine der am weitesten verbreiteten Anwendungen der CMF ist die Identifizierung von zellulären Subpopulationen im Blut oder lymphoiden Gewebe. Durch die Verwendung von fluoreszenzmarkierten monoklonalen Antikörpern können Lymphozytenarten, hämatopoetische Stammzellen oder Tumorzellen genau charakterisiert werden. Dieser Ansatz wird insbesondere bei der Diagnose und Überwachung von Leukämien, Lymphomen und anderen malignen hämatologischen Erkrankungen eingesetzt.

Zellzyklusanalyse und Apoptose

Durch die Markierung der DNA mit interkalierenden Farbstoffen kann die CMF die Verteilung der Zellen in den verschiedenen Phasen des Zyklus beurteilen und Phänomene des programmierten Zelltods (Apoptose) anhand von Markern nachweisen. Forscher setzen diese Analysen routinemäßig z. B. in der Krebsforschung und der Pharmakologie ein.

Zellsortierung (FACS)

Einige Zytometer, sogenannte Sorter(Fluorescence Activated Cell Sorters), ermöglichen es, Zellen von Interesse nach ihrer optischen Analyse durch ein elektrostatisches Ablenksystem physikalisch zu trennen. Diese Hochdurchsatzsortierung ist entscheidend für die Reinigung seltener Populationen, wie Stammzellen oder genetisch veränderter Zellen, für nachgelagerte Studien oder therapeutische Anwendungen.

Anwendungen in Mikrobiologie, Bioprozessen und Umwelt

Forscher verwenden CMF auch, um Bakterienpopulationen zu analysieren, die Lebensfähigkeit in Bioproduktionskulturen zu kontrollieren, Krankheitserreger nachzuweisen oder die mikrobiologische Qualität von Wasser zu überwachen. Seine Schnelligkeit und Genauigkeit machen es zu einem wertvollen Werkzeug für Industrielabore und Online-Verfahren.

Herausforderungen und Perspektiven

Obwohl die Durchflusszytometrie eine ausgereifte Technologie ist, steht sie noch vor mehreren technischen Grenzen und ruft zahlreiche Innovationen hervor, die ihre analytischen Fähigkeiten erweitern sollen.

Zu den wichtigsten Einschränkungen gehören :

• Spektralkompensation, die erforderlich ist, wenn mehrere Fluorochrome überlappende Emissionsspektren haben, was bei falscher Kalibrierung zu Interpretationsartefakten führen kann,
• Zellautofluoreszenz, insbesondere bei bestimmten Linien oder Primärproben, die schwache Signale überdecken kann,
• Die Lebensfähigkeit der Zellen, die häufig durch Markierungsbehandlungen oder Sortierbedingungen beeinflusst wird, wodurch einige klinische oder therapeutische Anwendungen eingeschränkt werden,
• Die Datenverarbeitung, die mit der steigenden Zahl der gemessenen Parameter komplex wird und fortgeschrittene Werkzeuge zur Visualisierung und statistischen Analyse erfordert.

Die jüngsten Fortschritte zielen darauf ab, diese Grenzen zu verschieben:

• Die Spektralzytometrie, bei der nicht mehr feste Filter verwendet werden, sondern das gesamte Spektrum jedes Fluorochroms analysiert wird, verbessert die Auflösung und die Fähigkeit, viele Marker gleichzeitig zu verwenden,
• Die bildgebende Zytometrie(imaging flow cytometry), eine Kombination aus Durchfluss und Mikroskopie, ermöglicht eine fortgeschrittene morphologische Analyse unter Beibehaltung des hohen Durchsatzes,
• Die Integration mit künstlicher Intelligenz, insbesondere mit Machine Learning, erleichtert die automatische Erkennung von zellulären Subpopulationen in komplexen Datensätzen,
• Mikrofluidische Ansätze schließlich tendieren dazu, Zytometer zu miniaturisieren und sie für tragbare oder in On-Chip-Diagnosegeräte integrierte Analysen kompatibel zu machen.

Mit diesen Entwicklungen etabliert sich die Durchflusszytometrie als Schlüsseltechnologie in der personalisierten Medizin, der biomedizinischen Spitzenforschung und der industriellen Biotechnologie.

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