¿Qué es la citometría de flujo?
La citometría de flujo (FMC) es una técnica de referencia para analizar partículas suspendidas en un fluido. Permite medir simultáneamente varias características físicas y biológicas de cada partícula. Este es el caso típico de las células o bacterias a una velocidad de hasta varios miles de eventos por segundo.
El principio se basa en la inyección hidrodinámica de la muestra en un flujo. El objetivo es obligar a las partículas a alinearse para atravesar sucesivamente uno o varios haces láser focalizados. Cada partícula dispersa la luz al interactuar con el haz. Fluoróforos específicos pueden marcarla, permitiéndole emitir una señal fluorescente. La dispersión frontal(FSC) proporciona una estimación del tamaño celular. La dispersión lateral (SSC) proporciona información sobre la complejidad interna, como la granularidad citoplasmática. Las señales de fluorescencia reflejan la expresión de objetivos biológicos específicos.
Estas señales luminosas son recogidas por una red de fotodetectores (fotodiodos, fotomultiplicadores). A continuación, se convierten en señales eléctricas, se digitalizan y se analizan en tiempo real. La citometría de flujo permite clasificar, cuantificar y ordenar subpoblaciones celulares. Esto se hace sobre la base de varios criterios simultáneamente, con alta sensibilidad y reproducibilidad.
¿Cómo funciona la citometría de flujo?
Un citómetro de flujo se estructura en torno a tres subsistemas principales: fluídica, óptica y electrónica de detección. Estos módulos trabajan en sinergia para garantizar un análisis fiable y reproducible de cada evento medido.
El sistema fluídico
El corazón del sistema fluídico se basa en el principio de la focalización hidrodinámica. La muestra que debe analizarse se inyecta en el centro de un flujo de líquido fisiológicamente neutro. Esto obliga a las partículas a fluir en fila india. Esta configuración garantiza que los eventos detectados correspondan a una sola partícula cada vez. Así se evitan solapamientos o errores de recuento.
El sistema óptico
A continuación, las partículas alineadas pasan a la cámara de análisis. Son iluminadas por uno o varios láseres de longitudes de onda específicas. La luz incidente se dispersa o se absorbe y luego se reemite en forma de fluorescencia si la partícula está marcada. Las lentes colectoras y otros elementos ópticos dirigen la luz hacia distintos detectores.
Los dos tipos de dispersión, FSC y SSC, proporcionan una estimación física (tamaño y complejidad). Las señales fluorescentes revelan información biológica o bioquímica sobre la partícula, en función de los marcadores utilizados.
El sistema de detección
Los fotodiodos o fotomultiplicadores (PMT) convierten cada señal óptica en una señal eléctrica y, a continuación, un sistema la digitaliza. El procesamiento posterior se realiza mediante software especializado para extraer los parámetros medidos.
El control de calidad de los citómetros incluye calibraciones periódicas mediante perlas fluorescentes normalizadas. Esto garantiza la estabilidad y comparabilidad de las mediciones a lo largo del tiempo.
Aplicaciones prácticas de la citometría de flujo
La citometría de flujo es ahora indispensable en muchas áreas de las ciencias de la vida, gracias a su capacidad única para analizar rápidamente miles de células individuales con resolución multiparamétrica.
Inmunofenotipado y hematología
Uno de los usos más extendidos de la CMF es la identificación de subpoblaciones celulares en sangre o tejidos linfoides. Mediante el uso de anticuerpos monoclonales marcados con fluorescencia, es posible caracterizar con precisión tipos de linfocitos, células madre hematopoyéticas o células tumorales. Este método se utiliza en particular para el diagnóstico y el seguimiento de la leucemia, el linfoma y otras neoplasias hematológicas.
Análisis del ciclo celular y apoptosis
Al marcar el ADN con colorantes intercalantes, la CMF permite evaluar la distribución de las células en las distintas fases del ciclo y detectar la muerte celular programada (apoptosis) mediante marcadores. Los investigadores utilizan habitualmente estos análisis en la investigación oncológica y la farmacología, por ejemplo.
Clasificación celular (FACS)
Algunos citómetros, conocidos como sorters(Fluorescence Activated Cell Sorters), pueden separar físicamente las células de interés tras su análisis óptico, utilizando un sistema de desviación electrostática. Esta clasificación de alto rendimiento es esencial para purificar poblaciones raras, como células madre o células modificadas genéticamente, para estudios posteriores o aplicaciones terapéuticas.
Aplicaciones en microbiología, bioprocesos y medio ambiente
Los investigadores también utilizan la CMF para analizar poblaciones bacterianas, controlar la viabilidad en cultivos de bioproducción, detectar patógenos o controlar la calidad microbiológica del agua. Su rapidez y precisión la convierten en una valiosa herramienta para laboratorios industriales y procesos en línea.
Retos y perspectivas
Aunque la citometría de flujo es una tecnología madura, aún se enfrenta a una serie de limitaciones técnicas y está dando lugar a numerosas innovaciones destinadas a ampliar sus capacidades analíticas.
Las principales limitaciones son :
- Compensación espectral, necesaria cuando varios fluorocromos tienen espectros de emisión que se solapan, lo que puede dar lugar a artefactos de interpretación si se calibran incorrectamente,
- Autofluorescencia celular, sobre todo en determinadas líneas o muestras primarias, que puede enmascarar señales débiles,
- La viabilidad celular, que a menudo se ve afectada por los tratamientos de etiquetado o las condiciones de clasificación, lo que limita determinadas aplicaciones clínicas o terapéuticas,
- El tratamiento de los datos, que se vuelve más complejo a medida que aumenta el número de parámetros medidos y requiere herramientas avanzadas de visualización y análisis estadístico.
Los últimos avances pretenden hacer retroceder estos límites:
- La citometría espectral, que ya no utiliza filtros fijos sino que analiza el espectro completo de cada fluorocromo, mejora la resolución y la capacidad de utilizar muchos marcadores simultáneamente,
- La citometríade flujo de imágenes, que combina flujo y microscopía, permite realizar análisis morfológicos avanzados manteniendo un alto rendimiento,
- La integración con la inteligencia artificial, en particular el aprendizaje automático, facilita el reconocimiento automático de subpoblaciones celulares en conjuntos de datos complejos,
- Por último, los enfoques microfluídicos tienden a miniaturizar los citómetros y hacerlos compatibles con análisis portátiles o integrados en dispositivos de diagnóstico en chip.
Con estos avances, la citometría de flujo se está consolidando como una tecnología fundamental en la medicina personalizada, la investigación biomédica de vanguardia y las biotecnologías industriales.
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